生物胺在人类和动物生理学功能上扮演着非常重要的角色，与食品腐败和安全直接相关。从常规饮食中摄入低量生物胺并不危险，但是若摄入量过高则会引起低血压（组胺、腐胺和尸胺）、高血压（酪胺）、偏头痛（酪胺和苯乙胺）、恶心、皮疹、晕眩、心输出量增加，以及呼吸加速。在很多种食物如鱼、肉、奶酪、水果、蔬菜和巧克力中都有可能产生生物胺。食品在被食用前为了评估其潜在的健康隐患而进行生物胺的测定显得至关重要。

　　生物胺通常采用反相HPLC，UV或者荧光检测。由于绝大多数生物胺缺少合适的发光和荧光基团，所以需要进行柱前或柱后衍生后才能检测。最常用的衍生试剂包括丹磺酰氯、苯酰氯和o-苯二醛（OPA）。这些衍生步骤在耗费时间、人力的同时还导致了潜在的副产物干扰，使得胺的测得量或高或低。

　　 应用注解183（AN183）介绍了IonPac CS18，一种弱酸型阳离子交换柱，与抑制型电导检测、积分脉冲安培检测（IPAD）和紫外检测(UV)联用无需衍生测定肉和奶酪中的生物胺。CS18柱无需使用高浓度酸淋洗液和有机溶剂就可以分离生物胺，且同样可以保证洗脱相近峰如腐胺和尸胺的分离。温和的分离条件使得抑制型电导也可以检测许多未经衍生的生物胺。IPAD对抑制后缺少一个电荷的生物胺同样可以检测，此法已经应用于巧克力中生物胺的测定。UV则可用来确认与其它胺或氨基酸共淋洗的弱保留芳香生物胺的存在和浓度。在本应用注解中， 使用AN183中的程序来测定猕猴桃、菠菜和巧克力中的生物胺。

　　设备

　　Dionex ICS-3000 系统包含有：

　　DP 带有在线脱气模块的双泵；

　　DC 检测/色谱 单元（双温控区），配有电导和电化学池，电化学池包括一个pH/Ag/AgCl参比电极和

　　常规Au电极（PN 063722）；

　　EG 淋洗液发生器单元：EluGen EGC Ⅱ MSA 罐（P/N 058902）；

　　AD25 UV-Vis 吸收检测器，配有10-mm 混合T型池，三通，1.5mm i.d.（P/N 024314）；

　　编织反应管，125 uL（P/N 053640）；

　　两个4L塑料瓶组件用于外接水模式操作；

　　Chromeleon 6.7 色谱控制软件；

　　搅拌器（家庭和工业强度型）；

　　离心机（Beckman Coulter，Brea，CA）；

　　涡流混合器（Fisher Scientific）

　　试剂和标准

　　试剂 去离子水，I级纯，电阻率大于等于18MΩ·cm；

　　氢氧化钠，50%（w/w）(Fisher Scientific，SS254-1)；

　　甲烷磺酸，99%（Dionex公司，P/N 033478）

　　标准

　　多巴胺盐酸盐，(Sigma Chemical Co., H8502)；

　　色胺盐酸盐， ≥98% (Sigma Chemical Co.,H9523)；

　　酪胺, 99%（Aldrich Chemical Co., T90344)）；

　　腐胺二盐酸盐，≥98% (Sigma Chemical Co.,7505)；

　　尸胺二盐酸盐，＞98% (Sigma Chemical Co., C8561)；

　　组胺，~97% (Sigma Chemical Co., H7125)；

　　胍丁胺硫酸盐，97% (Aldrich Chemical Co., 101443)；

　　β-苯乙胺，99% (Aldrich Chemical Co., 128945)；

　　亚精胺三盐酸盐，＞98% (Calbiochem, 56766)；

　　精胺四盐酸盐，≥99% (Calbiochem, 5677)
　　
　　测定条件

　　柱：IonPac CS18 Analytical，2×250 mm (P/N 062878)；IonPac CG18 Guard,2×50 mm(P/N 062880)；

　　淋洗液*：0–6 min, 3 mM MSA；6–10 min，3–10 mM；10–22 min, 10–15 mM；22–28 min, 15 mM；28–35 min,15–30 mM；35.1–45 min，30–45 mM。

　　淋洗液源：EG淋洗液发生器单元；

　　流速：0.30 mL/min；进样体积：5 μL；温度：40℃（下温控室），30℃（上温控室）；

　　检测方式：** 抑制型电导， CSRSULTRA Ⅱ (2 mm),外接水自抑制模式，电流设定为40mA，UV-Vis

　　检测设置为276 nm；背景电导: 0.4–0.5 μS； 电导噪音: 0.2–0.3 nS； 系统反压: ~2500 psi

　　柱后加入法：

　　检测方式：积分脉冲安培法（IPAD），常规Au电极；

　　柱后试剂流速：100 mM NaOH，0.24 mL/min；

　　IPAD背景：40–50 nC；

　　IPAD噪音：60–70 pC (没装抑制器)，~210 pC (装抑制器)

　　在进样前需先用3 mM MSA平衡柱子5min；

　　本注解中介绍了三种不同的检测配置：IPAD,抑制型电导-IPAD和UV-IPAD

　　系统准备和安装

　　AN183中涉及了IPAD、抑制型电导以及UV检测器的安装。在使用MSA和NaOH时，必须戴手套以避免肌肤接触。采取各种预防措施以避免NaOH的回流，否则会造成柱子的永久性伤害。

 　　溶液和试剂的制备

　　流动相

　　给EGC Ⅱ MSA罐提供高纯去离子水（电阻率 18MΩ· cm或更好）在线产生甲烷磺酸。 Chromeleon软件可以监控MSA罐的使用，并计算罐的剩余使用寿命。

　　另一方面，加入0.961g浓MSA到大约有500 mL 去离子水的1 L容量瓶中，稀释到刻度后摇匀得到10 mM MSA。加入9.61g浓MSA到大约有500 mL 去离子水的1 L容量瓶中，稀释到刻度后摇匀得到100 mM MSA。将淋洗液脱气后保存在塑料容器中。3 mM MSA通过10 mM MSA和去离子水按比例配制而得。梯度条件由100 mM MSA和去离子水按比例得到。

 　　IPAD柱后加碱溶液配制 100 mM NaOH

　　 取8 g 50% w/w NaOH加入到装有800 mL脱气后去离子水的1 L容量瓶中，并稀释到刻度，从而得到100 mM NaOH溶液。此溶液配制不可以使用粒状NaOH，因其表面覆盖一薄层碳酸钠。100 mM NaOH溶液必须一直保存在氦气加压瓶中。

　　酸提取溶液 100 mM甲烷磺酸 取4.81 g MSA到装有大约300 mL去离子水的500 mL容量瓶中。稀释到刻度，摇匀。此溶液保存在塑料容器中。

　　5%和1.5%三氯乙酸 取25 g三氯乙酸（TCA）到装有大约300 mL去离子水的500 mL容量瓶中。稀释到刻度，摇匀得到5%三氯乙酸溶液。此溶液保存在塑料容器中。

　　取30 mL 5% TCA溶液到装有大约50 mL去离子水的100 mL容量瓶中。稀释到刻度，摇匀得到1.5%三氯乙酸溶液。此溶液保存在塑料容器中。

　　标准溶液配制

　　分别溶解123.8 mg多巴胺盐酸盐，100 mg 182.7 mg腐胺二盐酸盐，171.4 mg尸胺二盐酸盐，96 mg组胺，120.7色胺盐酸盐，172.7 mg胍丁胺硫酸盐，100 mg苯乙胺，175.3 mg亚精胺三盐酸盐和172.1 mg精胺四盐酸盐到100 mL容量瓶中，用去离子水稀释到刻度，摇匀得到各种1000 mg/L生物胺贮备液。将贮备液在4℃下避光保存。分别稀释适量贮备液到3 mM MSA中得到制作校正曲线的工作标准溶液。这些溶液需要每周配制，并且不使用时在4℃下保存。

　　样品前处理

　　菠菜

　　取5 g基本样品到50 mL离心管中，并随后加入20 mL 100 mM MSA提取。使用涡流混合器混匀该混合物1 min，在转速6000 rpm 和4℃条件下离心20 min。倾出上清液，用0.2 μm滤头过滤到50 mL容量瓶
中。往离心管中再次加入20 mL MSA，重复进行萃取。上清液过滤到容量瓶中，并用去离子水稀释到刻度。在分析之前，提取液需要与去离子水1：1稀释。

　　猕猴桃和巧克力（70%可可）

 　　猕猴桃和巧克力样品也是取5 g基本样品到50 mL离心管中，并随后加入10 mL 100 mM MSA提取。样品提取如同菠菜中所提及，但是无需在测定前进行稀释。

　　黑巧克力和牛奶巧克力

　　取2 g基本样品到15 mL离心管中，并随后加入4 mL 100 mM MSA提取。使用涡流混合器混匀该混合物1 min，在转速6000 rpm 和4℃条件下离心30 min。倾出上清液，用0.2 μm滤头分别过滤到容量瓶中，用离子水1：1稀释。

　　结果和讨论

　　生物胺的分离和检测

　　为生物胺的分离情况，以抑制型电导、积分脉冲安培和UV检测（为串接）。多巴胺、酪胺和色胺不能通过抑制型电导检测，因为他们在被抑制后缺少正电荷。因此，要检测10种生物胺就需要配合IPAD使用。色胺的存在与否之前使用IPAD确定，而UV检测同样也可以验证其存在。

　　生物胺的分离和检测(A. 抑制型电导，B. IPAD，C. 色胺使用UV检测)

 　　使用电解产生的MSA淋洗液可以简化方法，使得开发出分离目标生物胺最佳梯度的过程更加容易。电解产生淋洗液在之前的研究中还没有同IPAD一起使用过，因为MSA淋洗液产生过程中产生氧气。淋洗液中的溶解氧会对背景信号产生很大的变化，因此必须被脱除。通过使淋洗液通过EG脱气装置的淋洗液

　　通道、而外接水则通过其Regen通道从而脱除掉氧气。由于背景不再出现反复无常的变化，说明EG产生的氧气已经被脱除。EG只需要添加去离子水而简化了方法开发，避免了手工离线配制淋洗液时产生的潜在错误和不一致。

 　　系统性能

　　通过峰面积对浓度的列表可以估算出抑制型电导、IPAD和UV检测的线性范围。通过五个配制于3mM MSA中浓度递增的生物胺标准溶液作出工作曲线。表1中总结了三种检测条件下校正曲线数据和检测限。更多信息譬如重现性和精确度.

　　a、 酪胺可用UV和IPAD两种方法测定。

　　b、 ＜DL = 小于检测限

　　使用IPAD测定食品中生物胺

 　　本应用更新中测定食品中生物胺浓度参见表2。含70%可可的巧克力、黑巧克力和牛奶巧克力中总生物胺浓度分别为37.1、0.9和0 mg/kg。这个结果表明检测到的生物胺大部分来源于巧克力中存在的可可。 含70%可可的样品中含有腐胺、组胺、色胺、亚精胺和精胺，浓度分别为6.9、3.3、7.3、9.8和9.8 mg/kg。这些巧克力中胺的测定数据除了色胺之外，都与之前公布的分析结果一致。以前的报道称巧克力中的色胺浓度在16–61 mg/kg范围内。含有70%可可的样品中生物胺加标回收率在87.6-102.5%。

　　食材中譬如水果和蔬菜也普遍存在生物胺。水果中的胺含量有限定条件。本注解测定了猕猴桃中的腐胺、组胺、色胺、亚精胺和精胺。可检测到9.2 mg/kg的色胺比含70%可可的样品中浓度高25%。腐胺、
亚精胺和精胺是常见多聚胺，可以给植株适应极限环境提供特别保护。之前的研究表明西番莲中色胺浓度范围在1–4 mg/kg。

　　菠菜叶中检测到的最主要生物胺是组胺和亚精胺，浓度分别为61和48.5 mg/kg。未贮藏食品（包含AN183中测试样）中菠菜的亚精胺的浓度最高，其他绿色蔬菜中的高含量亚精胺也有相关报道。

　　4℃下贮藏3周；b＜DL = 小于检测限；c4℃下贮藏2周。

抑制型电导-IPAD监测在4℃贮藏期间食品中生物胺浓度的变化

 在贮藏之后猕猴桃和菠菜叶进行重新测定（表3）。菠菜叶中的生物胺浓度在4℃冰箱中贮藏3周后发
生了很大的变化。亚精胺浓度从48.5降低到3.3 mg/kg，而组胺和精胺则完全降解（图3），61 mg/kg组

胺的完全降解是一个很有意思的结果。为确保结果的准确性，样品只用IPAD进行重新测定，此法可以用
于确认组胺的不存在。早期的研究结果标明在蔬菜产品在冰箱中保存三周后腐胺、亚精胺和精胺的浓度
发生了改变。尽管Leuschner等证明某些微生物能够降解组胺，但是找不到任何相关蔬菜中组胺降解的数
据。猕猴桃在4℃贮藏2周后，组胺大约降低了82%，亚精胺增加了25%，而精胺浓度则没有改变。贮藏
之后猕猴桃中的组胺完全被降解。

图3 菠菜中生物胺分离和检测（A）IPAD(新鲜样品)和（B）抑制型电导（4℃下贮藏三周）

结论

 多聚弱酸阳离子交换柱IonPac CS18可以用于分离各种食品样品中的生物胺，检测方式可以为IPAD、

抑制型电导和UV。本方法使用简单的电化学产生的MSA淋洗液而无需使用溶剂和以前报道的腐蚀性淋洗
系统。此外，本法适用于很多种样品基体，并具有很好的精确度和回收率，避免了复杂和长时间的衍生
过程。三种不同的检测配制可以得到更多的信息，并确认酪胺的存在，提高测定结果的准确性。抑制型
电导测定相关生物胺具有较低的检出限，而食品样品中常见阳离子和胺类并不干扰色谱测定。作为电导
检测胺类的补充，IPAD可以检测到多巴胺、色胺和酪胺，而这些还可以用UV检测器进行确认。